摘要：建立一种快速、经济、实用的多重 PCR方法 ,能同时检测 5种常见致病菌。根据利用针对，鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和副溶血性弧菌毒力基因，分别设计5对引物并进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系 ,建立了快速检测针对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和副溶血性弧菌的多重 PCR 方法，最终的反应体系的终浓度：1×PCR buffer，MgCl2为2.0mM，dNTPs为0.15mM，exTaq酶为2.0U，鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌上下游引物浓度分别为：0.8μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM，每种菌模板添加量为1μL，加ddH2O补足50μL。95℃预变性3min；94℃变性30s；59℃复性30s；72℃延伸30s，经过32个循环；72℃后延伸10min。 

初步建立能快速、灵敏、特异地检测针对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和副溶血性弧菌的多重 PCR体系 ,可以作为食物病原菌检测的有效方法。

 

关键词：多重 PCR；食源性病原微生物；生鲜食品

 

目录

摘要

Abstract

1 前言-1

1.1 食源性致病菌与食品安全-1

1.2 食源性病原微生物-1

1.2.1沙门氏菌-1

1.2.2大肠杆菌O157:H7-2

1.2.3金黄色葡萄球菌-3

1.2.4副溶血弧菌-4

1.2.5 单核细胞增生李斯特氏菌-4

1.3.1食源性致病菌的传统检测方法-5

1.3.2 常规PCR技术-5

1.3.3 DNA探针杂交技术-5

1.3.4 多重PCR(multiplex PCR)-5

2 本实验的目的和意义-8

3 材料与方法-8

3.1 材料与试剂-8

3.1.1 菌株-8

3.1.2 主要试剂-9

3.1.3 仪器设备-9

3.2 实验方法-9

3.2.1 细菌的培养和模板的制备-9

3.2.2 引物设计-9

3.2.3 多重PCR引物浓度优化-10

3.2.4 MgCl2浓度优化-11

3.2.5 exTaq 酶优化-11

3.2.6 dNTPs Mixture优化-12

3.2.7 10×Ex Taq Buffer优化-12

3.2.8 退火温度优化-12

3.2.9 多重PCR引物间特异性验证-13

3.2.10 多重PCR菌间特异性验证-14

3.2.11 多重PCR反应检出限检测-14

3.2.12多重PCR方法在生鲜食品中的应用-14

3.3 结果与分析-14

3.3.1 引物浓度优化结果-14

3.3.2 MgCl2浓度优化结果-16

3.3.3 exTaq 酶优化结果-16

3.3.4 dNTPs Mixture优化结果-17

3.3.5 10×PCR Buffer优化结果-17

3.3.6 退火温度优化结果-18

3.3.7 多重PCR引物间特异性结果-19

3.3.8 多重PCR菌间特异性结果-20

3.3.9 多重PCR检出限检测结果-21

3.5 实验总结-24

参 考 文 献-25

致    谢-28