摘要:本实验以摇床培养的经亚硝酸诱变的灵芝原生质体为研究对象，采用水饱和正丁醇提取胞外三萜，甲醇提取胞内三萜，比色法测定胞内、胞外三萜产量。实验结果表明：灵芝原生质体制备条件为，采用复合酶（1%蜗牛酶+1%纤维素酶+1%溶壁酶），37℃下酶解2h。亚硝酸诱变的最佳条件是0.06mol/L，诱变1min，此时诱变第一代菌株胞内、胞外三萜产量达到了最高，分别为44.14mg/g、4.75×10-2mg/mL，比原发菌株分别提高了162.89%  70.25%。经传代后第一代、第二代和第三代胞内三萜类产量分别较原发菌株提高了162.89 %、136.75 %、110.60 %；第一代、第二代、第三代胞外三萜类产量分别较原发菌株提高了70.25%、43.01%、30.82%。

关键词 灵芝；原生质体；亚硝酸；诱变；三萜类化合物

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摘要

Abstract

1 绪论-1

1.1 灵芝的概况-1

1.2灵芝的化学成分-1

1.2.1三萜类化合物的结构和功能-2

1.2.2灵芝三萜类化合物的提取方法-3

1.2.3灵芝三萜类化合物的检测方法-3

1.3 诱变育种-4

1.3.1物理诱变-4

1.2.2 化学诱变-5

1.4 原生质体诱变技术-7

1.5 本论文研究的目的及意义 -7

2 材料与方法-8

2.1 实验试剂与仪器-8

2.1.1实验试剂-8

2.1.2实验仪器-8

2.2 实验方法-9

2.2.1实验材料-9

2.2.2灵芝菌种的活化与培养-9

2.2.3灵芝原生质体的制备-9

2.2.4原生质体的化学诱变与再生-10

2.2.5灵芝三萜类化合物的测定-10

2.2.6遗传性状稳定性实验-11

2.2.7酶法提取灵芝胞外三萜类化合物-11

3 结果与讨论-12

3.1 灵芝三萜类化合物标准曲线的制作-12

3.2诱变后菌落形态-12

3.3亚硝酸诱变时间和致死率-13

3.4灵芝三萜类产量的测定-14

3.4.1胞内三萜的测定-14

3.4.2胞外三萜的测定-16

3.5高产灵芝三萜类菌株遗传稳定性测定-17

3.6酶法提取灵芝三萜类化合物-18

结论-20

致谢-21

参考文献-22