摘    要

本文构建了WRKY40的亚细胞定位和CHIP载体。实验从大豆中提取总RNA，逆转录成cDNA，接着与已设计好的引物克隆出我们所需的WRKY40基因，与T载体连接成为重组子并转入大肠杆菌中。通过限制性内切酶KpnI，SacI双酶切和KpnI单酶切分别将测序正确的WRKY40基因从T载体上切下来，分别进入植物表达载体pDL28-35S pro-RFP 和pDL28-35S pro-DHA-UbqDsRed，再将连接产物转入 K599 发根农杆菌中。为之后做WRKY40基因亚细胞定位和CHIP实验作铺垫。

目    录

1 前言 6

1.1 盐胁迫植物的危害 6

1.2 WRKY转录因子的结构 6

1.3 WRKY转录因子的功能 6

1.4 研究转录因子生物学功能常用的技术手段 7

1.5 载体构建 7

2 材料与试剂 7

2.1 实验材料 7

2.2实验器材 7

2.3 实验试剂 8

2.3.1 化学试剂 8

2.3.2 酶和引物 8

2.3.3 培养基 8

3 方法 9

3.1 克隆GmWRKY40基因的CDS序列 9

3.1.1 大豆根部总RNA提取 9

3.1.2 总RNA反转录成cDNA 9

3.1.3 克隆目的基因CDS序列 10

3.1.4 回收目的基因DNA片段 11

3.1.5 T-WRKY40载体构建 11

3.1.6 T-WRKY40转化大肠杆菌 12

3.1.7 质粒DNA的提取 12

3.2 含基因WRKY40真核表达载体构建 13

3.3 K599农杆菌转化 13

4 结果与分析 15

4.1 从大豆中提取总RNA结果 16

4.2 PCR扩增WRKY40结果 16

4.3 含基因WRKY40真核表达载体构建结果 16

4.3.1 T-WRKY40和pDL28-35S-RFP载体双酶切结果 17

4.3.2 菌液PCR验证重组质粒pDL28-35S pro-GmWRKY40-RFP结果 17

4.3.3 酶切验证重组质粒pDL28-35S pro-GmWRKY40-RFP结果 17

4.3.4 菌液PCR验证重组质粒K599-pDL28-35S pro-GmWRKY40-RFP结果 18

4.3.5 酶切验证重组质粒K599-pDL28-35S pro-GmWRKY40-RFP结果 18

4.3.6 T-WRKY40和pDL28-35S-DHA-UbpDsRed载体单酶切结果 18

4.3.7 菌液PCR验证重组质粒pDL28-35S pro-GmWRKY40-DHA-UbpDsRed结果 19

4.3.8 酶切验证重组质粒pDL28-35S pro-GmWRKY40-DHA-UbpDsRed结果 19

4.3.9 菌液PCR验证重组质粒K599-pDL28-35S pro-GmWRKY40-DHA-UbpDsRed结果 20

4.3.10 酶切验证重组质粒K599-pDL28-35S pro-GmWRKY40-DHA-UbpDsRed结果 20

5 讨论 21

参考文献 22

致谢 23