摘    要

西他列汀是一种治疗II型糖尿病的药物，可由西他列汀前体酮转氨制备。转氨酶可催化一种α-氨基酸的α-氨基转移到一种α-酮酸上的过程。相关文献表明转氨酶(ATA-117)可以催化西他列汀前体酮与异丙胺之间的转氨反应制备西他列汀,丙酮为该反应的副产物。鉴于转氨基作用是可逆的，需要几倍于底物的氨供体才能推动反应完全。本研究构建转氨酶、醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶级联反应，转氨副产物丙酮不断消耗，推动反应正向进行。本论文对该级联体系的构建进行研究。

本实验从实验室酶库中筛选出对丙酮具有催化活性的醛酮还原酶（AKRED-31），设计反应体系并初步验证消耗体系中副产物可推动转氨反应进行；由于底物西他列汀前体酮在体系中溶解性较差，本实验对体系助溶剂进行筛选，初步发现甲醇、乙腈和二甲基亚砜（DMSO）对西他列汀前体酮均具有良好溶解性；本研究进而对AKRED-31与葡萄糖脱氢酶的酶学性质进行了表征，葡萄糖脱氢酶的最适pH为7，最适温度为30℃，AKRED-31的最适pH为6，最适温度为35℃；研究中发现添加的助溶剂对两种酶活性的影响，通过实验确定添加10%-30%的DMSO条件最佳；本研究构建不同体积的酶级联反应体系，通过设置不加级联酶的空白对照，最终测得加入级联酶的反应产率比不加入级联酶的反应产率提高了约8%。由此可见构建循环体系可提高转氨反应的产率。

关键词： 西他列汀； 转氨酶； 酶级联； 化学平衡

目录

1.引言 5

1.1西他列汀及其制备研究进展 5

1.2转氨酶及其化学平衡 5

1.3本课题的研究目的及意义 6

1.4本研究的主要内容 7

2.材料与方法 7

2.1实验用酶 7

2.2实验主要试剂及仪器设备 8

2.3实验方法 9

2.3.1 醛酮还原酶的筛选 9

2.3.2 助溶剂种类的选择 9

2.3.3 醛酮还原酶的最适温度及最适pH 10

2.3.4 葡萄糖脱氢酶的最适温度及最适pH 11

2.3.5 助溶剂浓度的选择及其对两酶稳定性的影响 12

2.3.6 循环体系的初步构建 14

2.4 数据与分析 16

3.结果 16

3.1醛酮还原酶的筛选 16

3.2助溶剂种类的选择 16

3.3醛酮还原酶的最适温度与最适pH值检测 17

3.4葡萄糖脱氢酶的最适温度与最适pH值检测 18

3.5助溶剂浓度的选择及其对两酶稳定性的影响 19

3.5.1助溶剂浓度的选择 19

3.5.2 10%DMSO对两酶稳定性的影响 20

3.6级联体系的初步构建 21

4.分析与讨论 22

5.总结与展望 23

参考文献 23

致谢 24