摘要:无细胞蛋白表达体系，是一种以细胞提取物为基础进行体外合成蛋白质表达的技术。与传统的体内合成蛋白质技术相比，无细胞蛋白质合成（CFPS）技术能够进行廉价且快速的重组蛋白表达，具有遗传背景简单、反应与操作控制简便等特点。本文利用CFPS技术，在体外合成YycG、YycF蛋白，并用western blot分析检测蛋白的表达。YycFG（也称为WalRK，VicRK，MicAB或TCS02）双组分系统（TCS），是链球菌、芽孢杆菌和葡萄球菌等少数低G+C值革兰氏阳性菌中高度保守的必要双组分调节系统（essential two-component regulatory system，ETCS）。VicR（YycF）为应答调节蛋白（response regulator protein，RR or RRP），VicK（YycG）为膜相关组氨酸蛋白激酶（histidine protein kinase，HK or HPK）。由于其参与调节细胞壁代谢、调节氧化应激与被膜形成、细胞分裂、调节致病力、渗透压调节和维护胞膜完整等重要功能中起关键作用，该系统异常可导致细菌生活力严重下降，甚至死亡，yycF（vicR）非条件突变的细菌一般不能存活，因而成为预防及检测含有该 ETCS 微生物的首要靶标。

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关键词：细胞提取物；无细胞蛋白质表达系统（CFPS）；YycF(vicR)； VicK（YycG）；western blot

目录

摘要

ABSTRACT

第一章 文献综述-5

1.1引言-5

1.2.1 无细胞蛋白合成技术的发展-5

1.2.2 无细胞蛋白合成技术的原理和优势-6

1.2.3 影响无细胞体系蛋白合成的因素-8

1.2.4无细胞蛋白表达技术关键突破-8

1.3  YycFG双组分信号转导系统-9

1.3.1 双组分调节系统-9

1.3.2 YycFG双组分信号转导系统-10

1.4 Western blotting分析-10

1.4.1 Western-blot的原理及优势-10

1.3.2 影响Western-blot分析结果的因素-11

第二章 实验材料与方法-13

2.1 实验材料-13

2.1.1 实验菌株与质粒-13

2.1.2 主要试剂及规格-13

2.1.3  溶液配制-14

2.1.4实验仪器与设备-17

2.2  实验方法-17

2.2.1  大肠杆菌细胞抽提物的制备-17

2.2.2  质粒提取与检测方法-18

2.2.3  利用无细胞体系合成GFP、yycG、yycF蛋白以及后续检测-19

2.2.4  GFP、 yycG、YycF蛋白Western blot免疫印迹-21

第三章 实验结果及讨论-23

3.1 重组质粒的检测-23

3.2 利用无细胞体系合成GFP蛋白的结果检测-23

3.3  利用无细胞体系合成yycG、yycF蛋白-25

第四章 总结与展望-27

参考文献-28

附录I.  pIVEX 2.3d载体图谱-30

致    谢-31